Proteintech  PK10030  通用型總蛋白提取試劑盒

Proteintech  通用型總蛋白提取試劑盒-常備現(xiàn)貨

產(chǎn)品貨號：PK10030

產(chǎn)品名稱：通用型總蛋白提取試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格： 50T/100T

產(chǎn)品簡介：

Proteintech 通用型總蛋白提取試劑盒（PK10030）適用于提取各種動物、植物的細胞或組織樣品中的總蛋白，也可以用于真菌或細菌樣品中的總蛋白的提取，此款試劑盒提供的裂解液，能夠高效地提取總蛋白，主要包括細胞質(zhì)、細胞膜、細胞核、核基質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等蛋白，得到的總蛋白樣品可用于蛋白免疫印跡、免疫沉淀、Co-IP、ELISA檢測，蛋白質(zhì)分析和小規(guī)模蛋白層析純化等其他應(yīng)用。

 具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

產(chǎn)品說明：

關(guān)于試劑盒

●本試劑盒是一款廣譜、通用型的總蛋白的提取試劑盒，可用于大部分蛋白的提??；而對于一些低表達、易降解、磷酸化修飾、疏水性蛋白等特殊蛋白質(zhì)的提取推薦選用其對應(yīng)的專用提取試劑盒（見下表）。

●用于Co-IP實驗的樣品不要對樣品進行超聲波處理，也可將裂解液換成專用的Co-IP裂解液（PR20037），提升提取效果。

●裂解液在使用前需添加新鮮的蛋白酶抑制劑混合物。

●樣品制備完成后及時使用或分裝保存在-80℃。

●試劑盒開封后，裂解液可長期保存于4-8℃，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（4X）推薦分裝-20℃保存，試劑盒過期后建議不要使用。

使用方法

1、細胞樣品

a、瓶內(nèi)裂解法（效果zui 佳）：適用于所有的貼壁細胞

  （1）吸凈培養(yǎng)基，用冰的PBS清洗細胞表面2遍（動作輕柔，防止細胞脫落），盡可能吸取殘留的PBS。

（2）在冰上按每1000萬細胞加入1 mL預(yù)冷的裂解液（使用前添加新鮮的蛋白酶抑制劑混合物）于細胞瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，用移液管吹散貼壁的細胞，對于貼壁緊的細胞也可使用細胞刮收集，收集裂解液，在冰上放置30 min，期間每10 min上下顛倒混勻一次。

b、離心法：適用于懸浮細胞和藥物處理過的細胞

（1）使用細胞刮收集細胞懸液（連同培養(yǎng)基一起收集），4℃，500 g離心5 min，收集沉淀，沉淀用預(yù)冷的PBS洗滌兩遍，收集細胞沉淀，盡可能吸取殘留的PBS。

（2）按每1000萬細胞加入1 mL預(yù)冷的裂解液，在冰上放置30 min，期間每10 min上下顛倒混勻一次。

注：（1）細胞的收集優(yōu)先使用瓶內(nèi)裂解法處理，瓶內(nèi)裂解法可以有效的防止細胞在離心過程中破碎，能有效地提高總蛋白得率，同時也能保留細胞外基質(zhì)（ECM）。

（2）對于藥物處理過的貼壁細胞則推薦使用離心法收集，因為藥物處理過的細胞往往貼壁不牢，在PBS清洗階段容易丟失。

（3）不推薦使用yi酶消化，yi酶消化細胞不僅會造成細胞外基質(zhì)（ECM）的wan全丟失，同時會剪切一些對yi酶敏感的蛋白。

（4）一些細胞粘度高（HEK-293）和密度高的懸浮細胞（Jurkat、K562等）在加入細胞裂解液后容易形成絮狀物，此時應(yīng)及時的使用超聲破碎儀將其打散。

2、組織樣本

a、采集與保存：

（1）采集組織樣本前先對動物去除血液（血液去除越干凈越好），接著迅速解剖，采集所需要的組織樣本。

（2）組織樣本如需保存，可將采集的組織樣本液氮速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃保存。

（3）取樣順序：最先取胃腸道消化系統(tǒng)相關(guān)組織，接著取肺（巨噬細胞含量高）、肝臟（蛋白種類多）、膀胱、生殖系統(tǒng)相關(guān)的組織（睪丸、卵巢、子宮、輸卵管等），最后取心臟、脾臟、腎臟、骨骼肌、大小腦等組織。胃腸道消化系統(tǒng)相關(guān)組織推薦現(xiàn)取現(xiàn)制備，選用易降解蛋白提取試劑盒（PK10024)提取。

b、清洗

（1）對于血液含量豐富的組織樣本如：心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟等組織，剪碎使用冰的PBS洗滌液清洗2-3遍（可以適當(dāng)按壓排出血液），直至樣本血紅色變淺，濾紙吸干水分稱重。

（2）對于脂肪含量豐富的組織樣本，預(yù)先把樣本放在幾層紙巾上按壓，去除部分脂類，然后再使用冰的PBS清洗1-2遍，濾紙吸干水分稱重。

c、破碎及裂解

（1）液氮研磨法：將剪碎的組織塊在研缽中加入液氮，快速研磨至細粉狀，轉(zhuǎn)移至EP管中，按每100 mg組織加1 mL預(yù)冷的裂解液（使用前添加新鮮的蛋白酶抑制劑混合物），使用移液器上下吹打混勻，直至wan全溶解。在冰上放置30 min，期間每10 min上下顛倒混勻一次。

  （2）勻漿法：按每100 mg組織加1 mL預(yù)冷的裂解液（使用前添加新鮮的蛋白酶抑制劑混合物），將樣品轉(zhuǎn)移到合適大小的預(yù)冷玻璃勻漿器中，在冰浴條件下對樣品勻漿30-50次。在冰上放置30 min，期間每10 min上下顛倒混勻一次。

注：不同的樣品所需勻漿次數(shù)不同。鑒定方法：取20 ul勻漿30次后的組織樣品，加入等體積的0.4%臺盼藍溶液，混勻，在顯微鏡下觀察臺盼藍溶液染色陽性（藍色）細胞數(shù)目的比例，當(dāng)陽性（藍色）細胞wan全破碎，即可停止勻漿。若陽性（藍色）細胞破碎不wan全，則可適當(dāng)增加5-10次勻漿，隨后按照同樣的方法使用臺盼藍溶液進行鑒定。

 （3）冷凍研磨機法：提前開啟冷凍研磨機預(yù)冷，將吸干水分的組織樣本剪成1-2 mm左右的小塊，按照每管100 mg分裝到2 mL離心管，同時每管加入1粒5 mm的研磨珠。將離心管和適配器放入液氮里浸泡速凍。將離心管和適配器轉(zhuǎn)移到冷凍研磨機，使用65 Hz研磨45s，如果研磨效果不理想可中斷15s后重復(fù)研磨一次。每管加1 mL預(yù)冷的裂解液（使用前添加新鮮的蛋白酶抑制劑混合物），使用移液器上下吹打混勻，直至wan全溶解。在冰上放置30 min，期間每10 min上下顛倒混勻一次。

注：（1）優(yōu)先推薦選用液氮研磨法和冷凍研磨機法，其破碎效果zui 佳；如選用勻漿法，需在冰水浴中對樣品進行勻漿。

（2）使用冷凍研磨機法對液氮速凍過的樣本進行破碎，對離心管的材質(zhì)要求比較高，需選用專用的離心管。

3、昆蟲樣本

     將昆蟲清洗干凈，使用液氮研磨法、勻漿法或冷凍研磨機法（參考組織樣本的破碎及裂解方法）將其破碎，按每50-100 mg樣本加1 mL預(yù)冷的裂解液（使用前添加新鮮的蛋白酶抑制劑混合物），在冰上放置30 min，期間每10 min上下顛倒混勻一次。

4、植物樣本

   將植物清洗干凈，使用液氮研磨法或冷凍研磨機法（參考組織樣本的破碎及裂解方法）將其破碎（越碎越好），按每100-200 mg樣本加1 mL預(yù)冷的裂解液（使用前添加新鮮的蛋白酶抑制劑混合物），在冰上放置30 min，期間每10 min上下顛倒混勻一次。

   注：植物樣本不推薦使用勻漿法，液氮研磨法或冷凍研磨機法中液氮對破碎植物的細胞壁有非常好的效果。

5、超聲處理

   將裂解的蛋白樣品放在冰上超聲破碎，200W，2 min（開2s，關(guān)2s），充分打斷核酸序列（用于Co-IP實驗的樣品不要對樣品進行超聲波處理）。

6、樣品的使用與保存。

6.1  用于免疫沉淀、ELISA等非變性蛋白分析實驗，4℃，10000 g離心5 min分離上清，取部分樣品用來測濃度，剩下的蛋白樣品可直接分成數(shù)管保存在-20℃或-80℃。

6.2  用于免疫印跡的變性蛋白分析實驗，取部分樣品用來測濃度，剩下的蛋白樣品按照3:1比例，混合蛋白樣品和SDS-PAGE上樣緩沖液。100℃沸水浴加熱5 min，以充分變性蛋白。冷卻至室溫后，4℃，10000 g離心5 min分離上清，可直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔或分成數(shù)管保存在-20℃或-80℃。

注：用于免疫印跡的變性蛋白分析，在加入SDS-PAGE上樣緩沖液煮樣后再離心，可提高總蛋白的得率。

Proteintech  通用型總蛋白提取試劑盒-常備現(xiàn)貨

產(chǎn)品訂購信息：

PK10030  通用型總蛋白提取試劑盒  50T/100T

PK10021  動物組織總蛋白提取試劑盒  30T